2、最适工作浓度的选择

在建立某一 ELISA 测定中，应对包被抗原或抗体的浓度和酶标抗原或抗体的浓度予以选择，以达到zui合适的测定条件和节省测定费用。下面以间接法测抗体和夹心法测抗原为例，介绍zui适工作浓度的选择方法。

（一）间接法测抗体

1．酶标抗抗体工作浓度的选择

（1）用 100ng/ml 人 IgG 进行包被，洗涤。

（2）将酶标抗人 IgG 用稀释液作一系列稀释后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。

（3）加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度（A），绘制曲线如图 15-10。读取 A 值在 1.0 时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。该酶标抗人 IgG 的工作浓度应为 1/1600。

2．棋盘滴定法选择包被抗原工作浓度

（1）用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。

（2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作 1:100 稀释，加样，保温，洗涤。

（3）加按工作浓度稀释的酶标抗人 IgG 抗体，保温，洗涤。

（4）加底物显色。加酸终止反应后读取 A 值。

（5）选择强阳性参考血清的 A 值为 0.8 左右、阴性参考血清的 A 值小于 0.1 的包被抗的的稀释度作为工作浓度。表 15-1 为本例的测定结果，表中数字为 A 值。从表中可见 1:200 为zui舒适的工作浓度。

表 15-1 间接 ELISA 法包被抗原工作浓度的选择

各类血清 抗原稀释度

1:50 1:100 1:200 1:400 1:800

强阳性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.42

弱阳性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.19

阴性 0.23 0.13 0.08 0.66 0.05

稀释液 0.09 0.02 0.02 0.02 0.04

（二）夹心法测抗原

在夹心法 ELISA 法中可用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度，举例如下：

夹心 ELISA 包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择

包被抗体的浓度及 参考抗原

酶标抗体稀释度 强阳性（25ng/ml）弱阳性（1.5ng/ml）阴性

10 μg/ml

1:1000 1.17 0.15 0.09

1:5000 0.46 0.03 0

1:25000 0.12 0 0

1 μg/ml

1:1000 ＞2 0. 25 0.10

1:5000 0.91 0.12 0.01

1:25000 0.25 0.01 0

0.1 μg/ml

1:1000 0.42 0.13 0.13

1:5000 0.11 0.03 0.02

1:25000 0.03 0 0

（1）抗体免疫球蛋白用包被缓冲液稀释至蛋白浓度为 10、1 和 0.1 μg/ml，分别在 ELISA 板上进行包被，每一浓度包括三个纵行，洗涤。

（2）在一个横行各包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行加入弱阳性抗原液，第三横行加入阴性对照液，保温，洗涤。

（3）将酶标抗体用稀释液稀释成三个浓度，例如 1:1000、1:5000 和 1:25000。分别加入每一包被浓度的一个纵行中，保温，洗涤。

（4）加底物显色。加酸终止反应后，读取 A 值。

（5）以强阳性抗原的 A 值在 0.8 左右、阴性参考的 A 值小于 0.1 的条件作最适条件，据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表 15-2 可看出包被抗体浓度可选用 1 μg/ml，酶标抗体的稀释度可选为 1:5000。为了进一步节省试剂，可以此浓度为基点，缩小间距再做进一步的棋盘滴定。